MSCs修饰受体胸腺对异种心脏移植免疫排斥反应的作用研究(2)
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1?材料与方法
1.1?主要试剂
Ficoll淋巴细胞分离液(SIGMA公司)；DMEM培养液，胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；中华眼镜蛇毒因子(CVF)(昆明倍捷公司)；CCK-8细胞计数试剂盒(日本同仁化学研究所)。
1.2?手术材料
二氧化碳培养箱(Heraeus.BB 5060)；8-0无创伤缝线(上海浦东金环医疗用品有限公司)；手术显微镜(YZ 20T-Ⅲ型)；超速冷冻离心机(Juoan MR1812 Inc.France)。
1.3?实验动物
豚鼠选择要求：雄性，健康，体重控制在400～450 g；大鼠选择要求：健康，SD雌性大鼠，体重控制在250～300 g。
1.4?实验方法
1.4.1?全骨髓贴壁筛选法?MSCs分离、培养、扩增。取三色豚鼠四肢长骨，抽取得到骨髓加入Ficoll分离液中进行30 min离心作用；用DMEM液调整吸取到的单个核细胞层中单核细胞密度，按1×106/L的密度分装接种于培养瓶中。在CO2(体积分数为5%)、含饱和湿度的37℃恒温培养箱中对培养瓶进行培养。待细胞生长达到80%融合时进行传代。当这些传代细胞完全融合时得到的即为BM-MSCs[1-2]，然后进行胰酶消化，吹打，制成细胞悬液。
1.4.2?胸腺修饰?大鼠取胸骨上部正中切口，暴露胸腺，胸腺内注射0.1 mL MSCs(1×105个/0.1 mL/次)。用4号针头缓慢注入，常规结扎穿刺点。注射结束后用生理盐水反复冲洗胸腺周围组织。
1.4.3?实验分组?供体豚鼠和受体SD大鼠各20只随机分成四组，每组5只，A组(对照组)；B组(胸腺修饰IT组)；C组(CVF组)；D组(IT加CVF组) ......
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