CTLA—4基因外显子49位点多态性与重症肌无力的相关性研究(1)
【摘要】 目的：探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)基因多态性与福建地区汉族重症肌无力(MG)患者的相关性。方法：PCR扩增、限制性片断长度多态性方法检测福建地区重症肌无力患者CTLA-4基因外显子1区的+49A/G位点多态性。结果：MG组和对照组的49A/G位点的基因型和等位基因比较均无统计学意义，MG组与CTLA-4的+49A/G多态性之间无明显联系(P>0.05)。但是MG组+49A/G位GG和非GG基因型比较有性别差异(字2GG=4.41，P=0.04)，男性患者的GG基因型频率多于女性患者。结论：在福建地区CTLA-4的外显子1区的+49A/G位点基因可能不参与MG的发病。
【关键词】 重症肌无力； 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4； 基因多态性
中图分类号 R3 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2015)5-0017-04
重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是乙酰胆碱受体抗体介导的、细胞免疫依赖的及补体参与的一种神经-肌肉接头处传递障碍的自身免疫性疾病。具体病因不明，目前发现高加索人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)表达、基因多态性与MG有相关性[1]，但是上述结论需要不同种族中心的证实；且基因表达和基因多态性的相关性仍有争议。本文探讨福建地区汉族人群CTLA-4基因多态性与MG的相关性，具体报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取笔者所在医院2008年7月-2013年6月就诊的90例重症肌无力患者作为MG组。诊断标准：典型临床表现、新斯的明试验、重频试验、单纤维肌电图检查。经笔者所在医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。其中男44例，女46例，均为汉族，平均发病年龄为(37.54±16.10)岁，平均病程为(35.74±49.93)周。胸腺CT或手术提示，胸腺瘤19例(21.11%)，胸腺增生15例(16.67%)。合并甲状腺功能亢进者10例(11.11%)。复发病32例(35.56%)，并发危象9例(10.00%)。根据Osserman的分型标准：Ⅰ型31例(34.44%)；Ⅱa型14例(15.56%)；Ⅱb型30例(33.33%)；Ⅲ型7例(7.78%)；Ⅳ型8例(8.89%)；Ⅴ型0例。另外选取同一时期在厦门大学附属中山医院进行体检的90例健康体检者或志愿者作为对照组，无自身免疫性疾病、与患者无血缘关系、近1个月无感染病史。对照组经Hardy-Weinberg定律检验后证实无选择性偏倚。两组患者的年龄、性别等一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
1.2 方法
总结CTLA-4基因外显子49位点多态性与MG的发病年龄、性别、病程、有无复发、危象、胸腺瘤、合并甲亢、治疗等相关性。
1.2.1 PCR扩增 QIAGEN公司提供的DNA提取试剂盒提取DNA，+49位点的PCR引物序列(上海生工生物技术公司合成)、退火温度和片段长度见表1。
1.2.2 CTLA-4的外显子1区+49位点的PCR反应体系 ddH2O 17 μl，10×Buffer 2.5 μl，MgCl2(25 mmol/L)
1.3 μl，dNTP(2.5 mmol/L)0.5 μl，上游引物(10 μmol/L)
1.1 μl，上游引物(10 μmol/L)1.1 μl，DNA模板1.5 μl。
1.2.3 反应条件 BIORAD公司的PCR自动扩增仪扩增。扩增条件：95 ℃变性5 min，随后35次循环为95 ℃持续30 s，以相应的退火温度59 ℃，退火45 s，72 ℃ 1 min，最后延伸时间为72 ℃ 5 min。PCR产物限制性片段长度多态性分析方法。
1.2.4 结果判定 49位点GG型存在的判定标准为146和25 bp大小的片段；AA型仅见171 bp片段；AG型可见171、146和25 bp片段，具体见图1。
图1 CTLA-4外显子49位点的酶切产物
1.3 统计学处理
采用SPSS 15.0统计软件对所得数据进行统计分析，分类变量用频率描述，数值变量用(x±s)表示，Hardy-Weinberg检测样本是否符合孟德尔遗传规律；基因型和等位基因频率用直接计数法，差异比较采用字2检验或Fisher确切概率法，检验均为双侧检验，统计学意义显著区间为P<0.05。
2 结果
2.1 MG组和对照组的CTLA-4基因+49A/G的基因型、等位基因分布差异
比较MG组和对照组CTLA-4基因的+49A/G位点的AA、AG、GG三种基因型频率的差异；两组均P>0.05，说明MG组和对照组的49A/G位点的基因型和等位基因比较均无统计学意义(P>0.05)，见表2。
2.2 MG组性别与CTLA-4的+49A/G多态性相关性
比较MG组中男女两组CTLA-4基因的+49A/G位点基因型频率的差异；其中字2GG=4.41，P=0.04提示两组之间GG基因型频率差异具有统计学意义，见图2；而其他基因型和等位基因均无统计学意义，见表3。
2.3 MG组临床分型与CTLA-4的+49A/G多态性相关性
不管根据发病年龄分为早发型(发病年龄<40岁)和晚发型(发病年龄>40岁)，还是比较眼肌型组、非眼肌型，MG两组在+49A/G位点的基因型频率和等位基因的差别，两组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。说明两组之间MG的+49 A/G位点的基因型和等位基因的比较差异均无统计学意义。, 百拇医药(彭忠伟等)
【关键词】 重症肌无力； 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4； 基因多态性
中图分类号 R3 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2015)5-0017-04
重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是乙酰胆碱受体抗体介导的、细胞免疫依赖的及补体参与的一种神经-肌肉接头处传递障碍的自身免疫性疾病。具体病因不明，目前发现高加索人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)表达、基因多态性与MG有相关性[1]，但是上述结论需要不同种族中心的证实；且基因表达和基因多态性的相关性仍有争议。本文探讨福建地区汉族人群CTLA-4基因多态性与MG的相关性，具体报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取笔者所在医院2008年7月-2013年6月就诊的90例重症肌无力患者作为MG组。诊断标准：典型临床表现、新斯的明试验、重频试验、单纤维肌电图检查。经笔者所在医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。其中男44例，女46例，均为汉族，平均发病年龄为(37.54±16.10)岁，平均病程为(35.74±49.93)周。胸腺CT或手术提示，胸腺瘤19例(21.11%)，胸腺增生15例(16.67%)。合并甲状腺功能亢进者10例(11.11%)。复发病32例(35.56%)，并发危象9例(10.00%)。根据Osserman的分型标准：Ⅰ型31例(34.44%)；Ⅱa型14例(15.56%)；Ⅱb型30例(33.33%)；Ⅲ型7例(7.78%)；Ⅳ型8例(8.89%)；Ⅴ型0例。另外选取同一时期在厦门大学附属中山医院进行体检的90例健康体检者或志愿者作为对照组，无自身免疫性疾病、与患者无血缘关系、近1个月无感染病史。对照组经Hardy-Weinberg定律检验后证实无选择性偏倚。两组患者的年龄、性别等一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
1.2 方法
总结CTLA-4基因外显子49位点多态性与MG的发病年龄、性别、病程、有无复发、危象、胸腺瘤、合并甲亢、治疗等相关性。
1.2.1 PCR扩增 QIAGEN公司提供的DNA提取试剂盒提取DNA，+49位点的PCR引物序列(上海生工生物技术公司合成)、退火温度和片段长度见表1。
1.2.2 CTLA-4的外显子1区+49位点的PCR反应体系 ddH2O 17 μl，10×Buffer 2.5 μl，MgCl2(25 mmol/L)
1.3 μl，dNTP(2.5 mmol/L)0.5 μl，上游引物(10 μmol/L)
1.1 μl，上游引物(10 μmol/L)1.1 μl，DNA模板1.5 μl。
1.2.3 反应条件 BIORAD公司的PCR自动扩增仪扩增。扩增条件：95 ℃变性5 min，随后35次循环为95 ℃持续30 s，以相应的退火温度59 ℃，退火45 s，72 ℃ 1 min，最后延伸时间为72 ℃ 5 min。PCR产物限制性片段长度多态性分析方法。
1.2.4 结果判定 49位点GG型存在的判定标准为146和25 bp大小的片段；AA型仅见171 bp片段；AG型可见171、146和25 bp片段，具体见图1。
图1 CTLA-4外显子49位点的酶切产物
1.3 统计学处理
采用SPSS 15.0统计软件对所得数据进行统计分析，分类变量用频率描述，数值变量用(x±s)表示，Hardy-Weinberg检测样本是否符合孟德尔遗传规律；基因型和等位基因频率用直接计数法，差异比较采用字2检验或Fisher确切概率法，检验均为双侧检验，统计学意义显著区间为P<0.05。
2 结果
2.1 MG组和对照组的CTLA-4基因+49A/G的基因型、等位基因分布差异
比较MG组和对照组CTLA-4基因的+49A/G位点的AA、AG、GG三种基因型频率的差异；两组均P>0.05，说明MG组和对照组的49A/G位点的基因型和等位基因比较均无统计学意义(P>0.05)，见表2。
2.2 MG组性别与CTLA-4的+49A/G多态性相关性
比较MG组中男女两组CTLA-4基因的+49A/G位点基因型频率的差异；其中字2GG=4.41，P=0.04提示两组之间GG基因型频率差异具有统计学意义，见图2；而其他基因型和等位基因均无统计学意义，见表3。
2.3 MG组临床分型与CTLA-4的+49A/G多态性相关性
不管根据发病年龄分为早发型(发病年龄<40岁)和晚发型(发病年龄>40岁)，还是比较眼肌型组、非眼肌型，MG两组在+49A/G位点的基因型频率和等位基因的差别，两组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。说明两组之间MG的+49 A/G位点的基因型和等位基因的比较差异均无统计学意义。, 百拇医药(彭忠伟等)