新疆紫草PAL，HMGR，PGT基因的过表达和RNA干扰载体的构建(1)
[摘要] 新疆紫草Arnebia euchroma是药用紫草的主要来源，其最重要成分紫草素类化合物具有很高的药用和工业价值。研究采用GATEWAY技术，构建新疆紫草次生代谢关键酶基因PAL， HMGR， PGT的过表达载体和RNAi载体，为相关转基因株系的构建搭建好平台。新疆紫草次生代谢关键酶基因过表达和RNA干扰载体的构建，是基于遗传物质的遗传研究平台的搭建，对于次生代谢途径上基因功能验证和功能基因的挖掘提供了极大的便利，同时也填补了新疆紫草在转基因领域研究的空白，对于培育紫草素高产株系具有重要意义。
[关键词] 新疆紫草;过表达载体;RNAi载体;GATEWAY技术
[收稿日期] 2014-06-18
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81130070，81072989);国家科技支撑计划项目(2012BAI29B02，2012BAI28B002)
, 百拇医药
[通信作者] *郭兰萍，Tel：(010)64011944，E-mail：glp01@126.com
[作者简介] 谢腾，硕士，Tel：18310830559，E-mail：txwsxtws@163.com
新疆紫草Arnebia euchroma (Royle) Johnst是药用紫草的主要来源[1]，其重要成分紫草素类化合物具有止血、抗癌、抗HIV等多种药理活性[2-4]，同时也是天然的化工染料和食品添加剂[5-6]。
紫草素类化合物通常认为是在限速酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、甲戊二羟酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)和对羟基苯甲酸香叶基转移酶(PGT)催化下，通过苯丙氨酸(phenylpropan-oid，PP)-甲羟戊酸(mevalonate，MVA)复合途径合成。PAL是PP途径中的起始代谢酶，催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，进而开启对羟基苯甲酸(PHB)的合成。MVA途径上的HMGR将甲戊二羟酸单酰辅酶A还原为甲戊二羟酸，进而生成PP和MVA途径的中间产物焦磷酸香叶酯(GPP)。最后PHB，GPP在PGT的催化下合成紫草素类化合物前体香叶基-对羟基苯甲酸(GHB)[7-8]。
, 百拇医药
次生代谢通路上关键酶基因表达的变化会影响次生代谢物的生物合成，可以通过改变某特定基因的表达来调节下游次生代谢，即基因的过表达(或超表达)和RNA干扰(RNA interference， RNAi)技术，控制目标代谢产物的合成。为此，本研究拟构建新疆紫草次生代谢途径中关键酶基因PAL，HMGR，PGT过表达和RNA干扰载体，为培育新疆紫草次生代谢物高产株系和次生代谢相关基因的功能验证奠定基础。
1 材料
新疆紫草愈伤细胞取自中国科学院植物研究所叶和春研究员处。
基因过表达载体pH7WG2D和RNA干扰载体pK7GWIWG2D均由中国中医科学院中药资源中心提供。
2 方法
2.1 目的基因序列的获取和引物设计
, http://www.100md.com
在NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载目的基因序列：PAL(gi|90994675)，HMGR(gi|91208650)，PGT(gi|158957516)。
过表达载体的片段为目标基因的全长，引物位于ORF外，RNA干扰的片段引物位于ORF内。使用Primer Premier 5分别设计含CACC接头和不加CACC接头的合适引物。
2.2 新疆紫草cDNA的获得
采用Trizol法新疆紫草愈伤组织细胞总RNA提取，并做RNA质量检测。使用TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，将新疆紫草新鲜RNA反转录为单链cDNA，并至于-20 ℃保存。
2.3 PCR扩增
, 百拇医药
2.3.1 通用PCR扩增 使用TaKaRa Ex Taq酶做普通PCR扩增，所用引物不加CACC接头。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。
2.3.2 菌液PCR扩增 使用TaKaRa Taq酶做菌液PCR扩增，所用引物不加CACC接头。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。
2.3.3 高保真PCR扩增 使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase PCR酶做高保真PCR扩增，以T载体克隆所得质粒为DNA模版，所用引物含CACC接头。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。
2.4 PCR产物的回收与纯化
PCR扩增产物回收与纯化使用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒。将所得到的DNA保存于-20 ℃。
2.5 PCR产物的T载体克隆
, 百拇医药
PCR产物的T载体克隆使用Promega的pGEM-T EasyVector Systems，4 ℃水浴过夜，转入DH5α，LB平板(氨苄霉素，Amp抗性)培养过夜，筛选菌落并菌液PCR验证。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。
2.6 转化大肠杆菌
选择Trans5α感受态细胞，吸取200 μL已转化的感受态细胞加到含相应抗生素LB琼脂培养基上，均匀涂开细胞，至液体被吸收，倒置平板，37 ℃过夜培养。筛选菌落并菌液PCR验证，1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。
2.7 质粒提取
质粒DNA提取使用QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒。
2.8 GATEWAY方法构建载体
GATEWAY技术是基于λ噬菌体位点特异性的成熟重组体系，由BP，LR 2个反应就构成，可同时转化多个基因，较其他载体构建方法快捷高效[9]。BP反应将目的基因从PCR产物重组到供体载体，从而形成入门载体(donor vector)，LR反应则将入门克隆重组入目的载体(destination vector)[10-11]。, http://www.100md.com(谢腾 刘玉忠 王升 刘谈 康利平 郭兰萍)
[关键词] 新疆紫草;过表达载体;RNAi载体;GATEWAY技术
[收稿日期] 2014-06-18
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81130070，81072989);国家科技支撑计划项目(2012BAI29B02，2012BAI28B002)
, 百拇医药
[通信作者] *郭兰萍，Tel：(010)64011944，E-mail：glp01@126.com
[作者简介] 谢腾，硕士，Tel：18310830559，E-mail：txwsxtws@163.com
新疆紫草Arnebia euchroma (Royle) Johnst是药用紫草的主要来源[1]，其重要成分紫草素类化合物具有止血、抗癌、抗HIV等多种药理活性[2-4]，同时也是天然的化工染料和食品添加剂[5-6]。
紫草素类化合物通常认为是在限速酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、甲戊二羟酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)和对羟基苯甲酸香叶基转移酶(PGT)催化下，通过苯丙氨酸(phenylpropan-oid，PP)-甲羟戊酸(mevalonate，MVA)复合途径合成。PAL是PP途径中的起始代谢酶，催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，进而开启对羟基苯甲酸(PHB)的合成。MVA途径上的HMGR将甲戊二羟酸单酰辅酶A还原为甲戊二羟酸，进而生成PP和MVA途径的中间产物焦磷酸香叶酯(GPP)。最后PHB，GPP在PGT的催化下合成紫草素类化合物前体香叶基-对羟基苯甲酸(GHB)[7-8]。
, 百拇医药
次生代谢通路上关键酶基因表达的变化会影响次生代谢物的生物合成，可以通过改变某特定基因的表达来调节下游次生代谢，即基因的过表达(或超表达)和RNA干扰(RNA interference， RNAi)技术，控制目标代谢产物的合成。为此，本研究拟构建新疆紫草次生代谢途径中关键酶基因PAL，HMGR，PGT过表达和RNA干扰载体，为培育新疆紫草次生代谢物高产株系和次生代谢相关基因的功能验证奠定基础。
1 材料
新疆紫草愈伤细胞取自中国科学院植物研究所叶和春研究员处。
基因过表达载体pH7WG2D和RNA干扰载体pK7GWIWG2D均由中国中医科学院中药资源中心提供。
2 方法
2.1 目的基因序列的获取和引物设计
, http://www.100md.com
在NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载目的基因序列：PAL(gi|90994675)，HMGR(gi|91208650)，PGT(gi|158957516)。
过表达载体的片段为目标基因的全长，引物位于ORF外，RNA干扰的片段引物位于ORF内。使用Primer Premier 5分别设计含CACC接头和不加CACC接头的合适引物。
2.2 新疆紫草cDNA的获得
采用Trizol法新疆紫草愈伤组织细胞总RNA提取，并做RNA质量检测。使用TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，将新疆紫草新鲜RNA反转录为单链cDNA，并至于-20 ℃保存。
2.3 PCR扩增
, 百拇医药
2.3.1 通用PCR扩增 使用TaKaRa Ex Taq酶做普通PCR扩增，所用引物不加CACC接头。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。
2.3.2 菌液PCR扩增 使用TaKaRa Taq酶做菌液PCR扩增，所用引物不加CACC接头。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。
2.3.3 高保真PCR扩增 使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase PCR酶做高保真PCR扩增，以T载体克隆所得质粒为DNA模版，所用引物含CACC接头。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。
2.4 PCR产物的回收与纯化
PCR扩增产物回收与纯化使用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒。将所得到的DNA保存于-20 ℃。
2.5 PCR产物的T载体克隆
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PCR产物的T载体克隆使用Promega的pGEM-T EasyVector Systems，4 ℃水浴过夜，转入DH5α，LB平板(氨苄霉素，Amp抗性)培养过夜，筛选菌落并菌液PCR验证。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。
2.6 转化大肠杆菌
选择Trans5α感受态细胞，吸取200 μL已转化的感受态细胞加到含相应抗生素LB琼脂培养基上，均匀涂开细胞，至液体被吸收，倒置平板，37 ℃过夜培养。筛选菌落并菌液PCR验证，1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。
2.7 质粒提取
质粒DNA提取使用QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒。
2.8 GATEWAY方法构建载体
GATEWAY技术是基于λ噬菌体位点特异性的成熟重组体系，由BP，LR 2个反应就构成，可同时转化多个基因，较其他载体构建方法快捷高效[9]。BP反应将目的基因从PCR产物重组到供体载体，从而形成入门载体(donor vector)，LR反应则将入门克隆重组入目的载体(destination vector)[10-11]。, http://www.100md.com(谢腾 刘玉忠 王升 刘谈 康利平 郭兰萍)