人参皂苷Rg1延缓脑衰老机制研究(1)
[摘要]神经系统退行性疾病是老年患者的常见病和多发病。前期研究发现人参皂苷Rg1有明显延缓脑衰老作用，但作用机制并不完全清楚。为研究人参皂苷Rg1抗脑衰老的可能机制，40只雄性SD大鼠随机分为正常组、Rg1正常组、脑衰老模型组、Rg1脑衰老模型组，每组10只(脑衰老模型组：大鼠皮下连续42 d注射D-半乳糖(120 mg·kg-1)，qd。Rg1脑衰老模型组：在脑衰老模型复制同时，16 d起开始腹腔注射人参皂苷Rg1(20 mg·kg-1)27 d， qd。Rg1正常组：大鼠皮下注射等量生理盐水，16 d起开始腹腔注射人参皂苷Rg1(20 mg·kg-1)27 d， qd。正常组：注射等时与等量生理盐水。模型复制结束或药物注射完成第2天进行相关实验。通过水迷宫实验、β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色实验、ELISA实验、酶标比色法实验、Southern blotting和PCR-ELISA实验检测各组大鼠的空间记忆能力、脑衰老情况、海马区IL-1和IL-6炎症因子变化、海马区抗氧化指标SOD和GSH变化以及海马区端粒长度和端粒酶活性变化。结果脑衰老模型组大鼠空间记忆能力减退，脑组织切片显示SA-β-Gal染色阳性颗粒增多，海马区SOD活性降低，GSH含量减少，IL-1，IL-6含量增多，端粒长度缩短，端粒酶活性降低。Rg1脑衰老模型组大鼠空间记忆能力有明显改善，SA-β-Gal染色蓝色颗粒减少，海马区SOD活性增高，GSH含量增多，IL-1，IL-6含量减少，端粒长度缩短受到阻止，端粒酶活性增高。Rg1正常组大鼠与正常组大鼠相比空间记忆能力增强，SA-β-Gal染色蓝色颗粒减少，海马区IL-1，IL-6含量减少。结果表明人参皂苷Rg1可能通过调节端粒系统、炎症因子水平和抗氧化作用发挥延缓脑衰老作用。
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[关键词]人参皂苷Rg1；脑衰老模型；抗衰老；端粒系统；机制
神经系统退行性疾病已成为严重危害人类健康的重大疾患，因此对其深度研究已成为当今神经生物学与临床治疗学研究的热点和重点课题。最新理论认为，神经干细胞(NSCs)衰老与多种神经系统退行性疾病密切相关[1-2]。人参皂苷Rg1是人参重要的抗衰老成分，它能有效调控NSCs衰老，促进其增殖分化，有明确益智与延缓脑衰老作用[3]。但人参皂苷Rg1延缓脑衰老的分子机制还不清楚。本课题通过构建脑衰老模型，研究人参皂苷Rg1延缓脑衰老与调控端粒途径的分子机制。课题旨在阐述人参延缓脑衰老的现代生物学机制，为防治神经系统退行性疾病提供理论和实验依据。
1材料与方法
1.1动物雄性SD大鼠，体重(180±30) g，8～12周龄。重庆市医学实验动物中心购买， 合格证号为SCXK(渝)2007-0001。
, 百拇医药
1.2药品与试剂人参皂苷Rg1(吉林宏久公司，纯度98.6%)；衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)试剂盒 (Cell Signaling公司)；ELISA试剂盒(博士德公司)；SOD， GSH检测试剂盒，BCA法蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司)；端粒探针(Invitrogen公司合成)；定量RT-PCR试剂(Sangon公司)。
1.3脑衰老动物模型复制雄性SD大鼠随机分组，每组10只。脑衰老模型组：大鼠皮下注射D-半乳糖(120 mg·kg-1)，qd×42。Rg1脑衰老模型组：在脑衰老模型复制同时，16 d起腹腔注射人参皂苷Rg1(20 mg·kg-1)，qd×27。Rg1正常组：大鼠皮下注射等量生理盐水，16 d起开始腹腔注射人参皂苷Rg1(20 mg·kg-1)，qd×27。正常组：注射等时与等量生理盐水。模型复制结束或药物注射完成第2天进行相关实验。
1.4水迷宫实验检测大鼠空间记忆能力模型复制结束或药物注射完成第2天，进行Morris水迷宫实验，检测各组大鼠空间记忆能力。隐藏平台搜索实验：每天按同样随机顺序依次从4个入水点将大鼠面向池壁放入，设置时间为120 s，规定时间内未找到平台记为逃避期120 s，将引导鼠上平台，每只鼠平台停留时间为30 s，每天测量每组4次逃避潜伏期平均值，共检测5 d。空间搜索实验：第6天，撤掉平台，选择离平台较远的两象限入水点入水，测量120 s内动物在目标象限的时间和穿越目标次数。
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1.5脑组织切片与β-半乳糖苷酶染色10%水合氯醛麻醉大鼠，经心脏依次灌注生理盐水100 mL，4%多聚甲醛100 mL，30%蔗糖100 mL，灌注结束后断头取脑，快速放于液氮中，按冷冻切片常规处理，以脑冠状缝后3～5 mm处为标点制备10 μm冠状面切片，切片置-20 ℃保存。染色时切片先复温0.5 h，按试剂说明书进行操作。步骤如下：加入SA-β-Gal染色固定液，37 ℃固定30 min，PBS浸泡切片10 min，加入SA-β-Gal染色工作液，37 ℃湿盒中孵育过夜，PBS浸泡切片后封片，光镜下观察分析。
1.6ELISA检测海马区炎症因子IL-1， IL-6的变化将分离获得的各组海马组织放入1 mL EP管，按20 mg组织加200 μL蛋白裂解液与2 μL的PMSF，4 ℃下匀浆，冰上静置5 min；4 ℃，12 000×g离心5 min。取上清，按BCA法测定蛋白浓度。将各组质量浓度调整为5 g·L-1，按试剂说明要求进行操作，步骤如下：加稀释液将样品质量浓度调整为2.5 g·L-1，每孔加100 μL调整浓度后的样品，设置2个复孔， 37 ℃保温90 min；遗弃酶标板内液体，倒扣滤纸上30 s；每孔加100 μL生物素标记抗体，37 ℃保温60 min；移除液体， PBS洗涤3次，加ABC工作液100 μL，37 ℃保温30 min；PBS洗涤5次，每孔加90 μL TMB，锡箔纸包裹避光，37 ℃保温40 min；每孔加100 μL的TMB终止液，酶标仪450 nm测定吸光度A。, 百拇医药(李成鹏 张梦思 刘俊 耿珊 李静 朱家红 张岩岩 贾道勇 王璐 王顺和 王亚平)
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[关键词]人参皂苷Rg1；脑衰老模型；抗衰老；端粒系统；机制
神经系统退行性疾病已成为严重危害人类健康的重大疾患，因此对其深度研究已成为当今神经生物学与临床治疗学研究的热点和重点课题。最新理论认为，神经干细胞(NSCs)衰老与多种神经系统退行性疾病密切相关[1-2]。人参皂苷Rg1是人参重要的抗衰老成分，它能有效调控NSCs衰老，促进其增殖分化，有明确益智与延缓脑衰老作用[3]。但人参皂苷Rg1延缓脑衰老的分子机制还不清楚。本课题通过构建脑衰老模型，研究人参皂苷Rg1延缓脑衰老与调控端粒途径的分子机制。课题旨在阐述人参延缓脑衰老的现代生物学机制，为防治神经系统退行性疾病提供理论和实验依据。
1材料与方法
1.1动物雄性SD大鼠，体重(180±30) g，8～12周龄。重庆市医学实验动物中心购买， 合格证号为SCXK(渝)2007-0001。
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1.2药品与试剂人参皂苷Rg1(吉林宏久公司，纯度98.6%)；衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)试剂盒 (Cell Signaling公司)；ELISA试剂盒(博士德公司)；SOD， GSH检测试剂盒，BCA法蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司)；端粒探针(Invitrogen公司合成)；定量RT-PCR试剂(Sangon公司)。
1.3脑衰老动物模型复制雄性SD大鼠随机分组，每组10只。脑衰老模型组：大鼠皮下注射D-半乳糖(120 mg·kg-1)，qd×42。Rg1脑衰老模型组：在脑衰老模型复制同时，16 d起腹腔注射人参皂苷Rg1(20 mg·kg-1)，qd×27。Rg1正常组：大鼠皮下注射等量生理盐水，16 d起开始腹腔注射人参皂苷Rg1(20 mg·kg-1)，qd×27。正常组：注射等时与等量生理盐水。模型复制结束或药物注射完成第2天进行相关实验。
1.4水迷宫实验检测大鼠空间记忆能力模型复制结束或药物注射完成第2天，进行Morris水迷宫实验，检测各组大鼠空间记忆能力。隐藏平台搜索实验：每天按同样随机顺序依次从4个入水点将大鼠面向池壁放入，设置时间为120 s，规定时间内未找到平台记为逃避期120 s，将引导鼠上平台，每只鼠平台停留时间为30 s，每天测量每组4次逃避潜伏期平均值，共检测5 d。空间搜索实验：第6天，撤掉平台，选择离平台较远的两象限入水点入水，测量120 s内动物在目标象限的时间和穿越目标次数。
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1.5脑组织切片与β-半乳糖苷酶染色10%水合氯醛麻醉大鼠，经心脏依次灌注生理盐水100 mL，4%多聚甲醛100 mL，30%蔗糖100 mL，灌注结束后断头取脑，快速放于液氮中，按冷冻切片常规处理，以脑冠状缝后3～5 mm处为标点制备10 μm冠状面切片，切片置-20 ℃保存。染色时切片先复温0.5 h，按试剂说明书进行操作。步骤如下：加入SA-β-Gal染色固定液，37 ℃固定30 min，PBS浸泡切片10 min，加入SA-β-Gal染色工作液，37 ℃湿盒中孵育过夜，PBS浸泡切片后封片，光镜下观察分析。
1.6ELISA检测海马区炎症因子IL-1， IL-6的变化将分离获得的各组海马组织放入1 mL EP管，按20 mg组织加200 μL蛋白裂解液与2 μL的PMSF，4 ℃下匀浆，冰上静置5 min；4 ℃，12 000×g离心5 min。取上清，按BCA法测定蛋白浓度。将各组质量浓度调整为5 g·L-1，按试剂说明要求进行操作，步骤如下：加稀释液将样品质量浓度调整为2.5 g·L-1，每孔加100 μL调整浓度后的样品，设置2个复孔， 37 ℃保温90 min；遗弃酶标板内液体，倒扣滤纸上30 s；每孔加100 μL生物素标记抗体，37 ℃保温60 min；移除液体， PBS洗涤3次，加ABC工作液100 μL，37 ℃保温30 min；PBS洗涤5次，每孔加90 μL TMB，锡箔纸包裹避光，37 ℃保温40 min；每孔加100 μL的TMB终止液，酶标仪450 nm测定吸光度A。, 百拇医药(李成鹏 张梦思 刘俊 耿珊 李静 朱家红 张岩岩 贾道勇 王璐 王顺和 王亚平)