不同寒热药性中药对酵母致热大鼠体温调节及温度敏感瞬时感受器电位离子通道(TRPs)蛋白的影响(1)
[摘要]目的：观察比较4种典型寒、热药性中药对酵母致大鼠发热模型体温的干预影响以及温度敏感瞬时感受器电位离子通道(TRPs)蛋白的调节作用。方法：背部皮下注射酵母混悬液建立大鼠发热模型，108只SD大鼠随机平均分为正常组、模型组、大黄组、黄连组、吴茱萸组和高良姜组，分别于造模后第4，8，12 h取下丘脑和背根神经节，通过免疫组化和Western blot方法检测下丘脑和背根神经节中温度敏感瞬时感受器电位离子通道蛋白TRPV1和TRPM8的水平。结果：与正常组相比，注射酵母后模型组大鼠体温明显上升，8 h达到高峰期(P<0.01)；下丘脑和背根神经节中TRPV1水平显著升高，TRPM8水平则明显降低。与模型组比较，大黄和黄连可显著降低酵母引起的大鼠体温升高，下调下丘脑和背根神经节中TRPV1水平，上调TRPM8水平(P<0.05或P<0.01)；吴茱萸和高良姜对发热大鼠的体温和TRPs均无明显影响。结论：寒性中药大黄和黄连能降低酵母致热大鼠的体温，其作用可能与其对下丘脑和背根神经节中TRPV1和TRPM8的有效调节有关；热性中药吴茱萸和高良姜无相关作用。
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[关键词]寒热药性；酵母；解热作用；TRPV1；TRPM8
近年来，基于中药药性-药效关系的研究作为中药药性研究的主要方法之一，得到了广泛的关注[1-2]。中药具有寒热之性，探讨寒性、热性中药在调治机体热性、寒性病理状态过程中起到什么作用，如何起作用，以及作用的程度如何，是研究中药寒热药性起效机制的关键。一般说来，药性相同的中药具有相同或相似的药效。而瞬时感受器电位离子通道蛋白(TRPs)，是近年来发现存在于细胞膜或胞内细胞器膜上的非选择性阳离子通道，该家族中多个家庭成员具有温度感知的生理功能，本实验拟通过2味典型寒性中药和2味典型热性中药对酵母致发热大鼠模型体温的干预影响以及对温度敏感TRPs的调节作用的比较，从一个新的角度来探寻寒、热性中药的功效和药性特征的关系，为药性的现代科学评价提供初步的实验依据。
1 材料
1.1 动物 SD雄性大鼠108只，体重(200±10) g，由中国中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(军)2007-004。
, 百拇医药
1.2 药品与试剂 大黄、黄连、吴茱萸和高良姜均由北京同仁堂药店提供，经中国中医科学院中药研究所胡士林教授鉴定，4味中药均为道地药材，制成水煎液，冷藏备用；酵母购自安琪酵母股份有限公司；兔抗TRPV1抗体和兔抗TRPM8抗体均购自以色列alomone labs公司，辣根酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；RIPA裂解液、Bradford蛋白定量试剂盒和ECL发光液均购自北京普利莱公司；两步法免疫组化检测试剂盒和DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器 BS224S电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；TD5A-WS低速台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；MC-347电子体温计[欧姆龙(大连)有限公司]；PowerPacTMBasic电泳仪(美国BIO-RAD公司)。
2 方法
2.1 酵母致发热模型 参照文献方法[3]，健康成年SD雄性大鼠，背部皮下注射(sc)20%酵母混悬液10 mL·kg-1。空白对照组大鼠sc等体积生理盐水。
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2.2 分组与给药 108只健康成年SD雄性大鼠，随机分为6组：正常组、模型组、大黄组、黄连组、吴茱萸组和高良姜组，每组18只。大鼠实验给药方法：除正常组外，所有动物先灌胃(ig)给予相应药物，1 h后sc酵母混悬液，造模后3.5 h再次给药(方式及剂量同首次)。各组每次ig给予药物及剂量分别为：大黄组(大黄水煎液3.5 g·kg-1)，黄连组(黄连水煎液2.8 g·kg-1)，吴茱萸组(吴茱萸水煎液4.2 g·kg-1)，高良姜组(高良姜水煎液6 g·kg-1)，正常组和模型组(蒸馏水2 mL·kg-1)。
2.3 体温监测 实验环境为常规日夜周期，室温(22±2) ℃，相对湿度(50±2)%，自由进食、饮水。对大鼠进行适应性培养(于实验环境中模拟实验操作)3 d后，禁食不禁水12 h，实验当日，每隔1 h测温1次，测3次，取均值作为基础体温，3次体温浮动超过0.5 ℃者舍弃。然后各组首次给予相应药物，1 h后造模，造模后8 h大鼠体温升高 >0.8 ℃为模型制备成功，选作实验动物入组。造模后3.5 h再次给药。造模后每隔1 h测温1次，直到实验结束。
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2.4 免疫组化染色 分别于造模后第4，8，12 h处死动物，取脑和背根神经节，4%多聚甲醛溶液固定72 h，包埋，制成5 μm冠状面连续切片。取组织石蜡切片，脱蜡至水，PBS冲洗3次，使用0.01 mol·L-1柠檬酸缓冲液进行抗原修复，3%的过氧化氢灭活内源性过氧化物酶室温孵育10 min，PBS洗涤后用5%血清封闭，滴加一抗(1∶100稀释)，置4 ℃过夜。用两步法免疫组化检测试剂盒进行下丘脑和背根神经节免疫组织化学染色。DAB显色，脱水，透明，封片。应用专业图像分析软件Image proplus6.0测得免疫组化图像中阳性区域IA值，下丘脑和背根神经节组织分别在200倍和400倍视野下进行统计。
2.5 Western blot检测 分别从下丘脑和背根神经节组织中提取蛋白，用Bradford蛋白质定量方法，进行蛋白定量。采用质量分数为12%的SDS-PAGE电泳检测，湿法转移至PVDF膜，脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入一抗(兔抗TRPV1或兔抗TRPM8，1∶100)，在4 ℃下孵育过夜。TBST洗膜后加入二抗(HRP标记山羊抗兔二抗，1∶3 000)，室温孵育2 h。使用兔抗GAPDH特异性抗体作为内参对照检测。使用ECL发光法检测特异性条带，QuantiScan 3.0分析软件分析条带IA。目的蛋白的IA除以正常组的IA以校正误差，所得结果代表目的蛋白相对表达量。, http://www.100md.com(万红叶 孔祥英 李晓敏 朱宏伟 苏晓慧 林娜)
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[关键词]寒热药性；酵母；解热作用；TRPV1；TRPM8
近年来，基于中药药性-药效关系的研究作为中药药性研究的主要方法之一，得到了广泛的关注[1-2]。中药具有寒热之性，探讨寒性、热性中药在调治机体热性、寒性病理状态过程中起到什么作用，如何起作用，以及作用的程度如何，是研究中药寒热药性起效机制的关键。一般说来，药性相同的中药具有相同或相似的药效。而瞬时感受器电位离子通道蛋白(TRPs)，是近年来发现存在于细胞膜或胞内细胞器膜上的非选择性阳离子通道，该家族中多个家庭成员具有温度感知的生理功能，本实验拟通过2味典型寒性中药和2味典型热性中药对酵母致发热大鼠模型体温的干预影响以及对温度敏感TRPs的调节作用的比较，从一个新的角度来探寻寒、热性中药的功效和药性特征的关系，为药性的现代科学评价提供初步的实验依据。
1 材料
1.1 动物 SD雄性大鼠108只，体重(200±10) g，由中国中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(军)2007-004。
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1.2 药品与试剂 大黄、黄连、吴茱萸和高良姜均由北京同仁堂药店提供，经中国中医科学院中药研究所胡士林教授鉴定，4味中药均为道地药材，制成水煎液，冷藏备用；酵母购自安琪酵母股份有限公司；兔抗TRPV1抗体和兔抗TRPM8抗体均购自以色列alomone labs公司，辣根酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；RIPA裂解液、Bradford蛋白定量试剂盒和ECL发光液均购自北京普利莱公司；两步法免疫组化检测试剂盒和DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器 BS224S电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；TD5A-WS低速台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；MC-347电子体温计[欧姆龙(大连)有限公司]；PowerPacTMBasic电泳仪(美国BIO-RAD公司)。
2 方法
2.1 酵母致发热模型 参照文献方法[3]，健康成年SD雄性大鼠，背部皮下注射(sc)20%酵母混悬液10 mL·kg-1。空白对照组大鼠sc等体积生理盐水。
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2.2 分组与给药 108只健康成年SD雄性大鼠，随机分为6组：正常组、模型组、大黄组、黄连组、吴茱萸组和高良姜组，每组18只。大鼠实验给药方法：除正常组外，所有动物先灌胃(ig)给予相应药物，1 h后sc酵母混悬液，造模后3.5 h再次给药(方式及剂量同首次)。各组每次ig给予药物及剂量分别为：大黄组(大黄水煎液3.5 g·kg-1)，黄连组(黄连水煎液2.8 g·kg-1)，吴茱萸组(吴茱萸水煎液4.2 g·kg-1)，高良姜组(高良姜水煎液6 g·kg-1)，正常组和模型组(蒸馏水2 mL·kg-1)。
2.3 体温监测 实验环境为常规日夜周期，室温(22±2) ℃，相对湿度(50±2)%，自由进食、饮水。对大鼠进行适应性培养(于实验环境中模拟实验操作)3 d后，禁食不禁水12 h，实验当日，每隔1 h测温1次，测3次，取均值作为基础体温，3次体温浮动超过0.5 ℃者舍弃。然后各组首次给予相应药物，1 h后造模，造模后8 h大鼠体温升高 >0.8 ℃为模型制备成功，选作实验动物入组。造模后3.5 h再次给药。造模后每隔1 h测温1次，直到实验结束。
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2.4 免疫组化染色 分别于造模后第4，8，12 h处死动物，取脑和背根神经节，4%多聚甲醛溶液固定72 h，包埋，制成5 μm冠状面连续切片。取组织石蜡切片，脱蜡至水，PBS冲洗3次，使用0.01 mol·L-1柠檬酸缓冲液进行抗原修复，3%的过氧化氢灭活内源性过氧化物酶室温孵育10 min，PBS洗涤后用5%血清封闭，滴加一抗(1∶100稀释)，置4 ℃过夜。用两步法免疫组化检测试剂盒进行下丘脑和背根神经节免疫组织化学染色。DAB显色，脱水，透明，封片。应用专业图像分析软件Image proplus6.0测得免疫组化图像中阳性区域IA值，下丘脑和背根神经节组织分别在200倍和400倍视野下进行统计。
2.5 Western blot检测 分别从下丘脑和背根神经节组织中提取蛋白，用Bradford蛋白质定量方法，进行蛋白定量。采用质量分数为12%的SDS-PAGE电泳检测，湿法转移至PVDF膜，脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入一抗(兔抗TRPV1或兔抗TRPM8，1∶100)，在4 ℃下孵育过夜。TBST洗膜后加入二抗(HRP标记山羊抗兔二抗，1∶3 000)，室温孵育2 h。使用兔抗GAPDH特异性抗体作为内参对照检测。使用ECL发光法检测特异性条带，QuantiScan 3.0分析软件分析条带IA。目的蛋白的IA除以正常组的IA以校正误差，所得结果代表目的蛋白相对表达量。, http://www.100md.com(万红叶 孔祥英 李晓敏 朱宏伟 苏晓慧 林娜)