铁皮石斛促生长内生真菌的筛选与鉴定(1)
[摘要]石斛生境中存在多种能够促进石斛生长的内生真菌，利用内生真菌与铁皮石斛组培苗共生培养，筛选对铁皮石斛组培苗有促生长活性的内生真菌，研究内生真菌对石斛根的侵染情况，采用形态鉴定和分子鉴定的方法对促生长活性内生真菌进行鉴定。结果表明，8株内生真菌对铁皮石斛苗有促生长作用，均能侵染铁皮石斛根，在铁皮石斛根的根被、外皮层、皮层中以菌丝或菌丝团的形式存在，不侵染内皮层和中柱，区别于有害真菌。8株活性内生真菌中，2株产孢真菌经形态鉴定，属于Pestalotiopsis，Eurotium属，6株不产孢真菌经分子鉴定，分别属于Pyrenochaeta，Coprinellus，Pholiota，Alternaria，Helotiales等5个属。促生长活性内生真菌与石斛组培苗共生培养，可促进石斛组培苗生长，对于缩短石斛生长周期，增加石斛中药材资源具有指导意义。
[关键词]铁皮石斛；内生真菌；促生长活性；侵染检测；菌种鉴定
铁皮石斛Dendrobium officinale是常用名贵中药材，具有益胃生津、滋阴清热等功效。由于石斛的自然繁殖率低，对环境条件要求较严格，产区药农长期采挖，自然资源已濒临灭绝。虽然石斛组织培养体系已成功建立，可大量繁殖石斛组培苗，但组培苗移栽成活率低，生长缓慢，成为石斛组培苗人工栽培的瓶颈。兰科植物与真菌能够形成典型共生关系，内生真菌或菌根真菌对兰科植物种子萌发、生长、成苗具有重要的促进作用。相同生境下的不同兰科植物有着相似的菌根真菌，而不同生境的同一兰科植物有不同的菌根真菌，两者间的共生关系是非专一性的[1]。范黎等[2]发现不同的真菌可促进同一种兰科植物的种子萌发，同一真菌也可与一种以上的兰科植物的种子形成共生关系。郭顺星等[3]分离的2株内生真菌对铁皮石斛苗有促生长的活性。吴慧凤等[4]也获得了9株对铁皮石斛有促生长作用的内生真菌。本试验探讨石斛属植物的内生真菌对铁皮石斛苗的作用，以期获得对石斛苗有促生长活性的内生真菌，为人工栽培石斛和组培苗移栽成活提供新的技术手段和理论基础。
, 百拇医药
1 材料
植物材料为铁皮石斛组培苗。内生真菌为分离自石斛属植物的36株内生真菌，由中国医学科学院药用植物研究所真菌室保存。
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂12 g，水1 L；组培培养基：1/2MS(大量成分减半)，马铃薯200 g，蔗糖30 g，活性炭2 g ，琼脂 7.5 g，水1 L，pH 5.8；共生培养基：1/2MS(大量成分减半)，蔗糖 7.5 g，琼脂 7.5 g，水1 L，pH 5.8。
2 方法
2.1 内生真菌的培养
内生真菌接种于PDA培养基上，25 ℃黑暗培养10 d。
2.2 铁皮石斛组培苗的培养
, 百拇医药
将铁皮石斛组培苗继代于组培培养基上，在培养温度(昼/夜)25 ℃/18 ℃、光照周期12/12 h、光强2 000 lx的条件下培养，至铁皮石斛苗长到4～6叶期。
2.3 共生培养
取4～6叶期、生长一致的铁皮石斛组培苗接种至含有50 mL共生培养基的三角瓶中，每瓶接种1株，将1片直径6 mm菌片接种在距苗1 cm处，对照接种1片直径6 mm的PDA培养基。置于培养温度(昼/夜)25 ℃/18 ℃、光照周期12/12 h、光强2 000 lx的条件下培养45 d。
2.4 促进铁皮石斛苗生长的内生真菌的筛选
共生培养结束后，根据植株形态指标衡量内生真菌的作用，去掉病苗、死苗，统计成活苗的株高、茎粗、分蘖、生根等的形态指标筛选出有促生长活性的内生真菌。
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2.5 内生真菌对铁皮石斛苗侵染的检测
共生的铁皮石斛苗根系以流水冲洗干净，切成0.5 cm小段，FAA溶液固定，石蜡包埋，切片，番红固绿对染，加拿大树胶封片，光学显微镜下观察。
2.6 促生长活性内生真菌的鉴定
2.6.1 形态鉴定 对产孢内生真菌的培养特性、显微形态特征进行观察，依据萨卡图(Saccardo)和休斯-塔巴基-巴伦(Hughes-Tabaki-Barron)真菌分类系统进行鉴定，分类检索参照文献[5-7]。
2.6.2 分子鉴定 对不产孢内生真菌依据rDNA 的内部转录间隔区(ITS)序列进行分子鉴定。内生真菌DNA提取采用CTAB法[8]，用通用引物ITS1：(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′)，ITS4：( 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) [9]扩增ITS 1，5.8S和ITS2的全序列。PCR反应体系50 μL：1×PCR buffer，MgCl2 3 mmol·L-1，4种dNTP各200 mmol·L-1，上下游引物各0.3 μmol·L-1，Taq酶2.0 U，DNA模板2 μL。反应程序：94 ℃预变性3 min，进入循环，94 ℃变性1 min，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃延伸8 min。PCR产物送上海生工测序。将不同真菌的ITS序列在GenBank中进行BLAST分析，寻找与查询序列相似性大于95%[10]的rDNA ITS序列，利用ClustalX 1.83软件进行全序列比对[11]，用Paup* 4b10软件[12]进行聚类分析，构建最大邻接树。根据聚类结果，对内生真菌进行分子鉴定。
3 结果与分析
3.1 促进铁皮石斛生长的内生真菌, http://www.100md.com(侯晓强 郭顺星)
[关键词]铁皮石斛；内生真菌；促生长活性；侵染检测；菌种鉴定
铁皮石斛Dendrobium officinale是常用名贵中药材，具有益胃生津、滋阴清热等功效。由于石斛的自然繁殖率低，对环境条件要求较严格，产区药农长期采挖，自然资源已濒临灭绝。虽然石斛组织培养体系已成功建立，可大量繁殖石斛组培苗，但组培苗移栽成活率低，生长缓慢，成为石斛组培苗人工栽培的瓶颈。兰科植物与真菌能够形成典型共生关系，内生真菌或菌根真菌对兰科植物种子萌发、生长、成苗具有重要的促进作用。相同生境下的不同兰科植物有着相似的菌根真菌，而不同生境的同一兰科植物有不同的菌根真菌，两者间的共生关系是非专一性的[1]。范黎等[2]发现不同的真菌可促进同一种兰科植物的种子萌发，同一真菌也可与一种以上的兰科植物的种子形成共生关系。郭顺星等[3]分离的2株内生真菌对铁皮石斛苗有促生长的活性。吴慧凤等[4]也获得了9株对铁皮石斛有促生长作用的内生真菌。本试验探讨石斛属植物的内生真菌对铁皮石斛苗的作用，以期获得对石斛苗有促生长活性的内生真菌，为人工栽培石斛和组培苗移栽成活提供新的技术手段和理论基础。
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1 材料
植物材料为铁皮石斛组培苗。内生真菌为分离自石斛属植物的36株内生真菌，由中国医学科学院药用植物研究所真菌室保存。
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂12 g，水1 L；组培培养基：1/2MS(大量成分减半)，马铃薯200 g，蔗糖30 g，活性炭2 g ，琼脂 7.5 g，水1 L，pH 5.8；共生培养基：1/2MS(大量成分减半)，蔗糖 7.5 g，琼脂 7.5 g，水1 L，pH 5.8。
2 方法
2.1 内生真菌的培养
内生真菌接种于PDA培养基上，25 ℃黑暗培养10 d。
2.2 铁皮石斛组培苗的培养
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将铁皮石斛组培苗继代于组培培养基上，在培养温度(昼/夜)25 ℃/18 ℃、光照周期12/12 h、光强2 000 lx的条件下培养，至铁皮石斛苗长到4～6叶期。
2.3 共生培养
取4～6叶期、生长一致的铁皮石斛组培苗接种至含有50 mL共生培养基的三角瓶中，每瓶接种1株，将1片直径6 mm菌片接种在距苗1 cm处，对照接种1片直径6 mm的PDA培养基。置于培养温度(昼/夜)25 ℃/18 ℃、光照周期12/12 h、光强2 000 lx的条件下培养45 d。
2.4 促进铁皮石斛苗生长的内生真菌的筛选
共生培养结束后，根据植株形态指标衡量内生真菌的作用，去掉病苗、死苗，统计成活苗的株高、茎粗、分蘖、生根等的形态指标筛选出有促生长活性的内生真菌。
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2.5 内生真菌对铁皮石斛苗侵染的检测
共生的铁皮石斛苗根系以流水冲洗干净，切成0.5 cm小段，FAA溶液固定，石蜡包埋，切片，番红固绿对染，加拿大树胶封片，光学显微镜下观察。
2.6 促生长活性内生真菌的鉴定
2.6.1 形态鉴定 对产孢内生真菌的培养特性、显微形态特征进行观察，依据萨卡图(Saccardo)和休斯-塔巴基-巴伦(Hughes-Tabaki-Barron)真菌分类系统进行鉴定，分类检索参照文献[5-7]。
2.6.2 分子鉴定 对不产孢内生真菌依据rDNA 的内部转录间隔区(ITS)序列进行分子鉴定。内生真菌DNA提取采用CTAB法[8]，用通用引物ITS1：(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′)，ITS4：( 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) [9]扩增ITS 1，5.8S和ITS2的全序列。PCR反应体系50 μL：1×PCR buffer，MgCl2 3 mmol·L-1，4种dNTP各200 mmol·L-1，上下游引物各0.3 μmol·L-1，Taq酶2.0 U，DNA模板2 μL。反应程序：94 ℃预变性3 min，进入循环，94 ℃变性1 min，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃延伸8 min。PCR产物送上海生工测序。将不同真菌的ITS序列在GenBank中进行BLAST分析，寻找与查询序列相似性大于95%[10]的rDNA ITS序列，利用ClustalX 1.83软件进行全序列比对[11]，用Paup* 4b10软件[12]进行聚类分析，构建最大邻接树。根据聚类结果，对内生真菌进行分子鉴定。
3 结果与分析
3.1 促进铁皮石斛生长的内生真菌, http://www.100md.com(侯晓强 郭顺星)